분자유전학및실험

13주. 유전체학 분석 기초 4: 식물 유전체 데이터베이스 활용 및 프로그램 활용 기초 4

서론 (Introduction)

유전체학의 눈부신 발전 과정을 통해 현재 많은 생물체들의 게놈 염기서열 분석이 완료되었고, 이를 통해 규명된 광대한 유전체 정보의 데이터베이스(DB)들이 웹사이트를 통해 연구자들에게 제공되고 있다. 이러한 DB의 가장 대표적인 종류는 미국 국립생물정보센터(NCBI)로서, 현재까지 밝혀진 게놈 정보들의 대부분을 이 데이터베이스를 통해 확인 및 분석이 가능하다. 한편, 모델 식물인 애기장대(Arabidopsis thanliana)의 경우 또한 독립적인 사이트(www.arabidopsis.org)를 통해 애기장대 게놈의 전체 염기서열 및 유전자들에 대한 다양한 데이터베이스들이 제공되고 있으며, 또한 이와 관련된 다양한 분석 tool 역시 제공되고 있는 상황이다. 본 실습은 이러한 애기장대의 데이터베이스를 이용하기 위한 기초 과정으로서, 기초적인 데이터베이스 활용법을 습득하고, 이러한 데이터베이스로부터 추출된 정보들을 어떻게 실제 연구 과정에 이용할 수 있는지를 유전자 분석 프로그램 활용을 통해 실습함으로써 유전자 분석의 기초를 익히고자 한다.

2. 재료 및 기구 (Materials and Apparatus)

인터넷이 연결된 실습 컴퓨터

유전자 분석 프로그램 : SERIAL CLONER 2.6

USB 저장 장치

3. 실험 방법 (Methods)

<BLAST 검색을 통한 유전자 탐색>

* 개요 : EST 등을 통해 부분적으로 얻어진 부분적인 DNA 염기서열이 어떤 유전자인지 확인하거나, 또는 다른 종의 유사 유전자를 찾아내고자 할 때와 같이 비슷한 염기서열을 가진 유전자를 찾을 때 많이 사용되는 방법이 “BLAST 검색법”이다. 본 실습에서는 애기장대 유전자의 부분적인 염기서열을 이용하여, BLAST 검색을 수행함으로써, 어떠한 유전자인지를 찾아내는 한편, 벼 등의 다른 식물체에 유사한 유전자가 존재하는지를 확인하는 실습을 수행함으로써, BLAST 검색법을 익힌다.

① “13주 실습용 파일 모음”을 다운로드해서 Sequence Cloner 메인 폴더에 복사해 넣는다.

② Sequence Cloner 프로그램을 실행한 후, Open을 클릭하여, Unknown01 ~ Unknown27중 하나를 연다 (-->“13주 실습 유전자 정보” 확인)

③ TAIR (www.arabidopsis.org) 홈페이지를 연 후, 메인 메뉴 중 Tools / WU-BLAST를 클릭한다. 이후 ②의 Unknown## 염기서열을 드래그하여 복사한 후 WU-BLAST 화면에 붙여넣기를 하고, 하단의 Run BLAST를 클릭하여 실행한다.

④ 결과 창에서 100% 상동성을 가지는 첫 번째 유전자가 무엇인지를 확인하고, 키보드상의 Prt Sc를 이용하여 해당 부분을 캡춰해서 저장한다.--> <결과 1>

⑤ ④ 유전자의 설명 앞쪽에 있는 AT#G#####.#을 클릭하여 유전자 정보를 확인한 후, full length CDS를 클릭하여, 전체 유전자 염기서열을 드래그하여 복사한 후, Sereal Cloner의 새 창에 붙여넣기하고, 저장한다. 저장 파일명은 해당 유전자 이름으로 지정한다.

⑥ NCBI site BLAST 검색 사이트 (blast.ncbi.nlm.nih.gov)를 연 후, Genomes 중에서 Oryza sativa (벼) 를 클릭한다. 이 때 뜨는 빈 창에 ⑤에서 저장한 염기서열을 복사/붙여넣기한 후, Program Selection에서 “Somewhat similar sequences (blastn)“을 선택한 후, 아래쪽의 “BLAST“ 버튼을 클릭한다. 이 때 뜨는 BLAST 검색 결과의 첫 번째 유전자 위치가 무엇인지를 확인하고, 키보드상의 Prt Sc를 이용하여 해당 부분을 캡춰해서 저장한다.

--> <결과 2>

<유전자 발현 양상 확인: AtGenExpress, e-FP browser, and ATTED-II>

* 개요 : 현재까지 지속적인 연구 과정을 통해 애기장대 게놈상에 존재하는 대부분의 유전자들의 기능 및 특성 분석이 계속해서 이루어지고 있다. 이러한 분석 과정에서 유전자 발현의 1차적인 산물인 전사체 분석 과정이 주로 마이크로어레이 혼성화 방법 또는 최근에는 RNA sequencing 방법을 통해 광범위하게 진행되고 있으며, 이러한 과정에서 축적된 정보들은 다양한 프로그램을 통해 공개적으로 분석이 가능하게 TAIR 사이트를 통해 제공되고 있다. 본 실습에서는 자신이 선택한 유전자의 발현 양상을 TAIR 사이트에 링크된 몇 개의 분석 DB를 통해 확인함으로써, 유전자 기능 분석의 기초를 익힌다.

① 앞 실험 ⑤의 유전자 Locus Detail 창에서, External Link에 있는 AtGenExpress Visualization Tool을 연다. 이 때 뜨는 창에서 Select experiment를 Hormones로 변경한 후, Run을 실행하고, 결과 그래프 및 표를 확인한다.

② 표의 내용 중, 첫 번째로 나오는 baseline wt의 0.5h, 1h, 3h H2O 처리시 수치를 옮겨 적고, 이후 baseline wt의 0.5h, 1h, 3h 1μM IAA 처리값 또한 옮겨 적는다. 각 시간별로 IAA / H2O 형태로 값을 계산하여, “IAA 처리시 선택 유전자의 시간별 발현 증감 양상 그래프”를 작성한다(엑셀 프로그램 이용). 또한, 같은 방식으로 10nM BL 처리시의 그래프 또한 같이 구한다.--> <결과 3>

③ 다시 Locus Detail 창으로 돌아와서 e-FP Browser를 클릭한 후, 결과 그림을 1차적으로 확인한다.

④ 결과 창에서 Data Source를 Root로 설정한 후 나타나는 결과 창을 확인하면, 뿌리에서 해당 유전자의 발현 양상이 나타난다. 왼쪽에 있는 뿌리 발현양상 그림을 저장한다. --> <결과 4>

⑤ 다시 Locus Detail 창으로 돌아와서 ATTED-II를 클릭한 후, 캡춰 또는 마우스 오른쪽 클릭/그림 저장 기능을 통해 저장한다. --> <결과 5>

⑥ 다시 Locus Detail 창으로 돌아와서 T-DNA express를 클릭한 후, Coexpressed gene network 그림을 확인한 후  유전자 부위의 돌연변이체 정보를 확인한 후, 화면을 캡춰해서 저장한다. --> <결과 6>

4. 결과 및 고찰 (Results and Discussion)

<결과 1> 유전자명 및 BLAST 결과 캡춰 화면

<결과 2> 벼 (Oryza sativa)의 유사 유전자 부위 캡춰 화면

<결과 3> IAA 및 BL 처리시 선택 유전자의 시간별 발현 증감 양상

<결과 4> 뿌리에서 선택 유전자의 공간적인 발현 양상 그림

<결과 5> 선택 유전자와 유사하게 발현되는 유전자 네트워크 캡춰 화면

<결과 6> 선택 유전자의 돌연변이 애기장대 식물체 정보 캡춰 화면

<고찰>

① <결과 3>, <결과 4>를 통해 선택 유전자의 발현 양상에 대해 설명하고 어떠한 특성을 보이는지 고찰하시오.

② <결과 5>에서 가장 근접하게 연관된 유전자가 어떤 유전자인지 확인한 후, 이 유전자의 특성을 간단하게 조사해서 설명하시오.